Идея клонирования воплощена в методе переноса ядра (nuclear transfer, NT) клетки-донора в энуклеированную неоплодотворенную яйцеклетку, находящуюся в метафазе второго деления мейоза [1]. Ранее источником ядра для подобных исследований служили эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), получаемые из доимплантационной бластоцисты [2], затем предпочтения стали отдавать более доступным клеткам взрослого организма [1, 3]. Цели научных разработок в данной области заключаются как непосредственно в получении клонов животных для лабораторных исследований, так и в выделении генетически идентичных клеткам реципиента линий ЭСК, которые могут использоваться в области клеточных биотехнологий без реакции отторжения и необходимого применения иммунодепрессантов [4].
В настоящее время достигнуты успехи методом переноса ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer, SCNT) в клонировании мышей [5], овец [3], коров [6], свиней [7]. Однако для медицины большее значение имела бы отработанная технология получения клонов приматов и их эмбрионального материала, которые могут быть использованы для исследований ряда заболеваний человека, разработки вакцин, получения биологически активных веществ, что, зачастую, неосуществимо на других животных [8]. Однако клонировать приматов не удавалось из-за процессов преждевременной активации цитоплазмы овоцитов и нарушения ядерного репрограммирования [4].
После введения донорского ядра и активации цитоплазмы яйцеклетки происходит ядерное ремоделирование, обусловленное деятельностью активирующего мейоз фактора (maturation promoting factor, MPF) и способствующее процессам репрограммирования. Активность MPF после проведения SCNT зависит от вида животных-доноров клеточного материала и от примененных протоколов метода [9]. До недавнего времени в опытах по клонированию приматов эффективность формирования бластоцист была очень низкой, наблюдалась преждевременная конденсациия хромосом и распад ядерной мембраны [4], что также связано с пониженной активностью MPF.
14 ноября в он-лайн версии журнала Nature были опубликованы результаты исследования J. A. Byrne и S. M. Mitalipov с соавт., которые получили бластоцисты макаки резуса и исследовали выделенные из них клонированные эмбриональные клетки (cloned rhesus embryonic stem, CRES) на предмет соответствия нормальным ЭСК животных.
В работе использовалась культура фибробластов кожи, полученная от девятилетней особи мужского пола, и овоциты (n=304) приматов (n=14). Ядра фибробластов электрофузией вводили в цитоплазму энуклеированных овоцитов, находящихся в метафазе II. Активация цитоплазмы производилась по специальным протоколам, включающим ряд краткосрочных последовательных инкубаций в различных условиях, что выгодно отличает схему от применявшихся ранее другими исследователями в работах по клонированию. Этот протокол позволил предотвратить преждевременную цитоплазматическую активацию и стимулировать деятельность MPF.
В эксперименте удалось получить только две "зиготы", образованные из овоцитов разных особей и ядер фибробластов взрослого макаки-самца. Таким образом, эффективность получения эмбрионов составила 0,7%. Культивирование производили до стадии бластоцист, из внутренней клеточной массы которых выделяли CRES. В дальнейшем сравнивали свойства двух линий клонированных клеток, полученных от ооцитов двух особей соответственно, между собой, с контрольной группой и культурой фибробластов кожи. Группу контроля составляли две линии ЭСК, полученных из оплодотворенных эмбрионов (донорами ооцитов служили те же особи, а спермы - второй самец).
Методами генетического анализа была показана идентичность ядерной ДНК обеих линий CRES и фибробластов кожи, а также лейкоцитов крови, полученных от того же животного-донора. Нормальный кариотип 42 XY был сохранен, однако у части клеток первой линии CRES выявлена изохромосома Y, состоящая из двух копий длинного плеча, а также у 12% CRES-1 наблюдалась потеря Y-хромосомы. Было доказано соответствие нуклеотидных последовательностей митохондриальных ДНК CRES и ооцитов женских особей-доноров. Эти данные в совокупности являются достоверным признаком клонированных клеток [4].
Обе линии демонстрировали типичную морфологию ЭСК, сохраняли недифференцированное состояние после 20 пассажей и экспрессировали ключевые факторы "стволовости", включая OCT4, SSEA-4, TRA1-60 и TRA1-81, что отражает успешное репрограммированеие. Двенадцать основных транскрипционных факторов, характерных для ЭСК макак резусов, были описаны в более ранней работе J. A. Byrne с соавт. (2006). Методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в молекуле ДНК клонированных клеток и группы контроля были определены гены NANOG, SOX2, LEFTYA, TDGF, TERT, высокий уровень экспрессии которых также служит критерием плюрипотентности и стволовости [10].
Транскрипционный анализ клеточных культур показал, что экспрессия 90% специфических соматических генов в обеих линиях CRES и контроля была существенно ниже по сравнению таковой в фибробластах кожи, а активность 85% генов, характерных для ЭСК, напротив, значительно выше.
Для оценки плюрипотентности клонированные клетки культивировали в условиях, необходимых для нейральной дифференцировки. В результате они приобретали удлиненную форму, экспрессировали соответствующие иммуногистохимические маркеры - ассоциированный с микротрубочками белок 2 (MAP2), ?-III-тубулин, тирозингидроксилаза. Кроме того, после инъекции в организм иммунодифецитных мышей обе линии CRES формировали тератомы, цитологический состав которых был характерен для тканей, развивающихся из всех трех зародышевых листков.
Ранее уже проводились эксперименты с клонированием приматов [8, 11]. В частности, S. M. Mitalipov с соавт. еще в 2002 году опубликовал материалы исследования, в котором получил бластоцисты макак резусов методом переноса в ооциты ядер фетальных фибробластов и ЭСК, полученных из оплодотворенных эмбрионов. Однако выделение клеток-доноров в этом случае предполагает значительно больше затрат ресурсов и времени, нежели в случае использования культуры фибробластов кожи взрослого животного. Более того, не представляется возможным использовать подобную методику в практике получения генетически идентичного клеткам реципиента пула ЭСК.
Таким образом, исследование J.A. Byrne и S. M. Mitalipov с соавторами открывает значительные перспективы, как минимум, в получении генетически идентичных клеткам реципиента ЭСК, а, как максимум, в клонировании человека. Тем не менее, во всех описанных работах мониторинг эмбрионов производился лишь до стадии бластоцисты, а не на протяжении всего эмбриогенеза и части постнатального развития, что оставляет возможные проблемы биолого-социального плана не раскрытыми.
Источник: http://www.celltranspl.ru/news/news1059, 27.05.2009
обратная связь
карта сайта